Validation of radioactive methods in the quality control of DNA restriction enzymes

Abstract

Biotecnologia Aplicada 1996 Volume 13 No.3, pp.197-200 Validation of radioactive methods in the quality control of DNA restriction enzymes Elder Pupo, Enrique Perez, Luis E Trujillo, Frank Miranda, Ernesto Gonzalez and Jose Brito Code Number:BA96078 Size of Files: Text: 21.0K Graphics:Line drawings (gif) - 5.1K Abstract In this paper two radioactive substrates obtained from lambda DNA digested with the restriction enzyme Hpa II were evaluated for the detection of 5'--} 3', 3'--} 5' single and double stranded-DNA dependent exonuclease and phosphatase activities found in DNA restriction and modifying enzyme preparations. A cloning simulation assay was performed using the same conditions established for the radioactive assay taking into account enzyme units and pmols of DNA ends used as substrate. As a result, it was found that for degradation of the radioactive DNA substrate per enzyme unit below 0.5 %, the false positives in the cloning simulation assay became less than 5 %. Finally, the use of the radiolabeled [gamma ^32P] ATP lambda Hpa II DNA substrate to detect 5'--} 3' single stranded-DNA dependent exonuclease and phosphatase contaminating activities is described at certain critical steps of the purification process of the restriction enzyme Kpn I. Key words: restriction/modifying enzymes, radiolabeled DNA, exonucleases, phosphatases Resumen En este trabajo se evaluaron dos sustratos radioactivos obtenidos a partir de ADN del fago lambda digerido con la restrictasa Hpa II, para la deteccion de exonucleasas con actividad 5'--} 3' dependiente de ADN de simple cadena, 3'--}5'dependiente de ADN doble cadena y fosfatasas presentes en preparaciones de enzimas de restriccion o modificacion del ADN. Fue realizada una simulacion de clonacion o ensayo de seleccion por blancas y azules donde se utilizaron las mismas condiciones empleadas para llevar a cabo el ensayo radioactivo en cuanto a cantidad de ADN (picomoles de extremos) empleado como sustrato y cantidades de enzimas ensayadas. Como resultado, se observo que para degradaciones del sustrato radiactivo menores al 0,5 % por unidad de enzima, el numero de falsos positivos encontrados en el experimento de clonacion se redujo a valores por debajo del 5 %. Finalmente, son mostrados algunos resultados obtenidos en la deteccion de exonucleasas 5'--} 3' dependientes de ADN simple cadena y fosfatasas en algunos pasos criticos en el proceso de purificacion de la enzima de restriccion Kpn I utilizando el sustrato [gamma ^32P] ATP lambda Hpa II. Palabras claves: enzimas de restriccion/modificacion, exonucleasas, fosfatasas Copyright 1996 Elfos Scientiae